养殖刺参寄生虫病病原学的初探
荣小军
1纤毛虫病
1.1材料与方法
1.1.1纤毛虫的来源
年9月~年9月进行的流行病学调查范围包括山东沿海的青岛、蓬莱、威海、荣成、牟平地区，获得的患病刺参体长5~25cm左右不等。分别取患病刺参的各组织器官制作成水浸片，逐一在NikonE显微镜下检查。
取到密布虫体的组织后，置于装有灭菌海水的13cm培养皿中(1支呼吸树:5ml海水)，在10℃恒温培养箱中保存，所获得的虫体作为形态学研究材料。
1.1.2纤毛虫的外部形态和内部结构研究
分离得到的纤毛虫置于显微镜下进行活体观察、拍照，永久制片采用宋微波的碳酸银染色法处理。分类系统参照Corliss。
一部分用于扫描电镜(SEM)观察的纤毛虫直接经Cloneys电镜固定液固定5min以上，PBS清洗3次，蒸馏水洗3次，各级酒精脱水5min.醋酸异戊酯10min，最后上样，临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察、拍照。
另一部分用于扫描电镜(SEM)观察的纤毛虫，在Cloneys电镜固定液固定前先用4%乙醇(以蒸馏水配置30%的盐水作为溶剂)进行人工脱毛，方法参照Christian，其余步骤同上部分扫描电镜样品的处理。
1.1.3组织病理学
取刺参的触手、体壁肌肉、消化道、呼吸树、性腺用Davidsons固定液固定36~48h后移入70%酒精中保存。组织块经各级酒精脱水、石蜡包埋，切片厚度为5μm，苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片后，NikonE显微镜下观察组织病理切片、拍照。
共有30头不同大小的病参用于组织病理学分析，所有样品均采用上述方法进行检查处理。同时，取10头健康海参的相应组织进行固定、切片，作为对照。
1.1.4纤毛虫的体外培养试验
取带有大量纤毛虫的组织分别置于灭菌海水、加呼吸树组织提取液的灭菌海水、加肠道组织提取液的灭菌海水、加体壁组织提取液的灭菌海水中，海水盐度28‰，在10℃恒温培养箱中进行培养，观察虫体增殖情况，选择最优的培养液。
1.1.5理化因子对纤毛虫存活的影响
1.5.5.1温度对纤毛虫存活的影响
用冰箱、水浴锅和恒温培养箱形成温度梯度，试验温度分别为0℃、4℃、8℃、12℃、13℃、14℃、16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃共12个梯度，各梯度设3个平行组。
用毛细玻璃管拉成的微吸管吸取50个虫体置于盛有10ml灭菌海水的细胞培养瓶(规格:25ml，表面积:12.5cm2)中，作为一个温度梯度组。其余梯度照此方法制备。每天分别在倒置显微镜下观察并记录各试验组纤毛虫的生活情况，连续观察8天。
1.5.5.2盐度对纤毛虫存活的影响
将灭菌海水分别用蒸馏水稀释或加入NaCI(分析纯)的方法配制成以下盐度梯度:0、5、10、15、20、25、28、30、35、40、45、50;各梯度设三个平行组。虫体的分装方法同1.5.5.1，虫体基数统一为50个。每天分别在倒置显微镜下观察并记录各试验组纤毛虫的生活情况，连续观察20天。
1.5.5.3pH对纤毛虫存活的影响
配制30‰NaCl(分析纯)溶液，℃高压灭菌15min后，分别以1MHCL和1MNaOH配制成不同pH值的海水。试验从pH2到pH12共分11个梯度，各梯度设三个平行组，虫体的分装方法同1.5.5.1，虫体基数统一为50个。每天分别在倒置显微镜下观察并记录各试验组纤毛虫的生活情况，连续观察4天。
1.1.6纤毛虫的体外感染实验
取密布纤毛虫的呼吸树的一个分枝，置于盛有15ml灭菌海水的细胞培养瓶中，共做3个实验组，每个实验组做3个平行组。
第一个实验组中加入无纤毛虫感染的新鲜呼吸树组织0.1g;第二几个实验组加入新鲜的无纤毛虫感染的肠道组织0.1g;第三个实验组加入新鲜的无纤毛虫感染的体壁组织0.1g。每天分别在倒置显微镜下观察并记录各试验组纤毛虫对加入组织的攻击情况。
1.2结果
1.2.1流行病学
近两周年的流行病学调查结果表明，在2~4月份和11~12月份，水温4℃~12℃左右，是适于该纤毛虫大量繁殖的季节和水温。
通过对海参各组织器官进行全面的水浸片检查和组织病理切片观察发现，除呼吸树外的其它组织上均未发现虫体，因此纤毛虫是专性寄生在海参呼吸树上的(图1B)。当该虫大量在呼吸树上繁殖，群体密度达到一定之后，会引起海参的排脏反应(图1A)。幼参和成参的呼吸树都可以感染该种纤毛虫，但从抽样调查的结果来看，以8cm以上的个体检出率最高。还未发现由于该纤毛虫的单独作用导致海参大量死亡的病例。但是，由于该虫的寄生能引发海参应急反应——“排脏”，从而影响了海参正常生长和对其它疾病的抵抗力。
图1患纤毛虫病的刺参
A.被纤毛虫感染后，刚排脏的刺参，箭头示排出的呼吸树;
B.A图中呼吸树的组织压片，呼吸树端部囊膜外有大量虫体寄生(箭头)
1.2.2形态描述(活体、电镜)
活体体长约40~78μm，宽约14~35μm，整体外观呈火炬状，前端钝圆，尾端宽大，背腹最大厚度位于体后端，厚约25μm；体纤毛密集，长约10μm；口器位于体后端截面上，口纤毛发达，长约14~50μm(图2)。
图2纤毛虫的活体DIC照片
大部分虫体运动不活跃，游离运动的个体少，多以反口面顶端或近顶端的纤毛加上体纤毛的连续运动吸附于基质之上。通过口纤毛有节律的持续摆动，将食物颗粒送入口部。少数脱离基质的个体运动时，体位通常无变化，少有绕虫体纵轴旋转前进的个体。虫体在灭菌海水的存活时间显著高于未灭菌海水，无嗜污性。
虫体内质较为透明，后部有一个伸缩泡，食物泡数目不定。多数虫体大小核各1枚，少数有2~3个大核(图3A,B,C)，大核为不规则的球形或椭球形，位于虫体中部。小核近球形，位于虫体前端1/10~1/5处，大核与小核的间距约9μm~35μm。
体动基列为混合式，约17~21列。在虫体的近腹面，第1列体动基列明显较长(图3B)，与口侧膜并行约10μm。口侧膜有呈“Zig-zag”排列的两列动基列构成(图3K~N)，并与3片小膜在虫体后端围绕达°，3片小膜中，第一小膜为最短，约两列毛基粒组成(图3L)；第二小膜为双列毛基粒构造，与口侧膜并行环绕于口围盘(图3L)；第三小膜位于第二小膜的一侧。
无性繁殖为不规则的横二分裂(图4A)，有性生殖为结合生殖，但结合位点有所不同(图4B~E)。
图3刺参后口虫的形态学特征
A.活体的DIC照片,显示具有3个大核,bar=10μm;B.氨银法染色,示虫体体动基列,bar=10μm;
C.氨银法染色,示纤毛虫的细胞核器,具2个大核的口器结构,bar=10μm;D.氨银法染色,示纤毛虫的口部结构,bar=10μm;
E.氨银法染色,纤毛虫的唇状凸起,bar=10μm;F.扫描电镜示未经过脱毛处理的背面结构,箭头示口部长纤毛,bar=10μm;
G,H.扫描电镜示经过脱毛处理的虫体背面唇状凸起和腹面观结构,bar=10μm;
1.扫描电镜示未经过脱毛处理的虫体反口面纤毛,bar=2μm;J.扫描电镜示未经过脱毛处理的虫体的纤毛列,bar=1μm;
K-N.扫描电镜示经过脱毛处理的虫体口部结构,bar=2μm.
M-口;M1-小膜1;M2-小膜2;PM-缘膜;MA-大核;MI-小核;LA-唇状凸起
表1刺参后口虫的统计学特征(自蛋白银制片标本)
图4刺参后口虫的繁殖方式(活体)
A.裂殖的繁殖方式，从中部縊缩形成两个虫体，bar=10μm;B.两个从小核所在反口面开始结合生殖的虫体，bar=20μm;
C.显示两个从大核所在虫体中部区开始结合的虫体，bar=30μm;D.显示两个结合生殖的虫体连接处出现的“空泡”，bar=30μm;
E.显示两个结合生殖的虫体在连接处大、小核之间交换遗传物质，bar=30μm
1.2.3分类地位
根据该纤毛虫的外部形态特征、银浸法染色、扫描电镜及Corliss分类系统，该病原的分类地位是纤毛动物门(Ciliophora)、寡膜纲(Oligohymenophorea)、盾纤亚纲(Scuticocitiatia)、盾纤目(Scuticociliatida)、触毛亚目(Thigmotrichina)、鱼钩虫科(AncistridaeIssel)、后口虫属(BoveriaStevens)的种类。
1.2.4组织病理
根据大量的组织切片观察表明，虫体的大量繁殖会对呼吸树组织造成损伤(图5B-D),囊腔的内腔上皮组织脱落、变薄(图5D)。笔者还观察到呼吸树上的大量孢子囊，这很能是纤毛虫的一种感染途径。
图5患后口虫病刺参的呼吸树组织病理切片
A.正常的呼吸树横切面,显示具有3个大核,bar=60μm;B.呼吸树内腔中有大量虫体寄生(箭头),bar=50μm;
C.大量虫体寄生于于呼吸树囊腔中,虫体钻营囊腔内部组织,造成囊腔内上皮组织变薄(箭头),bar=70μm;
D.虫体聚集处,呼吸树囊膜组织薄化(箭头),bar=20μm;E.显示呼吸树内腔中大量孢子囊,bar=20μm;
F.显示E图呼吸树内孢子囊的放大,bar=20μm
1.2.5纤毛虫的体外培养
灭菌海水、加呼吸树组织提取液的灭菌海水、加肠道组织提取液的灭菌海水、加体壁组织提取液的灭菌海水，这三种培养液在8℃恒温培养箱中进行培养，都未发现虫体有大量增殖，并且三者无显著性差异。
1.2.6理化因子对纤毛虫存活的影响
1.2.6.1温度对纤毛虫存活的影响
该纤毛虫的适宜生存温度为4℃~12℃，虫体在0℃与4℃~12℃下虫体的存活时间差异性不显著，但虫体在4℃~12℃下的活力显著高于0℃组。结果见图6。
1.2.6.2盐度对纤毛虫存活的影响
该纤毛虫的适宜生存盐度为25‰~35‰，虫体耐高盐的能力显著高于耐低盐的能力，结果见图7。
1.2.6.3pH对纤毛虫存活的影响
该纤毛虫的适宜生存pH为7~9，结果见图8。
1.2.7纤毛虫的体外感染试验
游离活动的纤毛虫只“攻击”呼吸树这一组织，而对加入的肠道和体壁组织无任何损伤和趋附性，这说明该种纤毛虫的寄生专一性很强。
图6温度对纤毛虫存活的影响图7盐度对纤毛虫存活的影响
图8pH对纤毛虫存活的影响
1.3讨论
后口虫属(Boveria)纤毛虫最早由Stevens(,)在红刺参(Parastichopuscalifornicus)的呼吸树上发现，但当时由于实验条件和缺乏足够的样品，对该种纤毛虫的研究很粗略。Ikeda()较为详细报道了后口虫属的一个新种——唇后口虫(Boveialabialis)的形态学特点和结合生殖的方式。但该种与本文报道的Boveriasp.口围盘螺旋旋转的角度不同(前者为°，后者为°)。
国内徐奎栋等()报道了寄生于栉江瑶(Pinnapectinata)鳃表和外套腔的亚桶形后口虫(BoveriasubcylindricaStevens)。该种与BoveriasubcylindricaStevens最大的区别在于后者在口部边缘具有一个10μm~15μm的原生质凸起，而前者没有，所以该虫很可能是后口虫属的一个新种，与后口虫属的报道种比较而言，其特征与Boveialabialis最为相似，所以暂时命名为唇后口虫的相似种——类唇后口虫(Boveiacf.labialis)。
关于后口虫的研究以往学者多集中在分类和形态学研究上，本文采用了脱毛预处理过程后，在SEM下对于类唇后口虫的口部形态进行了详细观察，还对其体外培养条件和致病性进行了有益探索。
单纯依靠呼吸树的提取液没能成功获得虫体的体外增殖，说明该虫对于呼吸树提供的生态环境依赖性十分强，而在体外模拟海参体腔内提供的环境条件十分困难，这无疑影响了对该虫生活史和繁殖特点的深入研究。
笔者除了采取体外活组织感染的方法外，也尝试了注射和浸浴感染的方法，但都不如体外感染试验成功，究其原因可能有以下几个方面：
1)对该虫的生活史不清楚，无法确定到底在何种发育阶段才能感染海参的呼吸树；
2)无法进行虫体的体外大量增殖，很难获得足够浓度的虫体进行体外浸浴感染试验；
3)体腔注射感染的方法，一方面难以确定注射进入体内的纤毛虫不被海参在吞吐海水的过程中排出，另外注射纤毛虫时很难保证虫体不携带致病菌进入海参体内，所以感染的结果是大量细菌在海参体内繁殖，引起海参死亡，而虫体未能繁殖起来。若采取在体外将虫体注射到海参的呼吸树上的方法，则由于海参受到刺激会强烈收缩的反应而难以精确定位。
但从组织病理的研究结果来看，该虫的大量繁殖还是对海参有害的，应当引起一定的重视。在其侵入海参体内的途径方面，作者观察到有的海参呼吸树内腔内存在80μm×40μm左右的孢子囊(图5B)，孢子囊的大小与类唇后口虫小个体的大小接近，而且往往有大量该孢子囊存在的海参中，类唇后口虫的检出率很高。证明二者之间有一定的联系。
有关刺参的寄生虫性疾病除了作者在本文中的报道外，国内迄今未开展相关的研究工作，所以很多方面的研究方法还需要进一步的深入。
1.4参考文献
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